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    半定量RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結合在一起，提供了一種分析基因表達的快速靈敏的方法。RT-PCR用于對表達信息進(jìn)行檢測或定量。另外，這項技術(shù)還可以用來(lái)檢測基因表達差異或不必構建cDNA文庫克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內的RNA分析技術(shù)，更靈敏，更易于操作。

　　RT-PCR的模板可以為總RNA或poly(A)+選擇性RNA。逆轉錄反應可以使用逆轉錄酶，以隨機引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進(jìn)行。cDNA的合成首先在逆轉錄緩沖液中進(jìn)行，然后取出1/10的反應產(chǎn)物進(jìn)行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉錄和PCR在同時(shí)為逆轉錄和PCR優(yōu)化的條件下，在一只管中順次進(jìn)行。

　　實(shí)驗步驟：

　　Trizol法RNA提取步驟

　　1、提取總RNA

　　2、逆轉錄反應

　　3、PCR反應

　　以下實(shí)驗步驟僅供參考：

　　1樣品RNA的抽提

　?、偃龃嬉蚜呀獾募毎?，室溫放置5分鐘使其溶解。

　?、趦上喾蛛x

　　每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lv仿，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lv仿相，中間層以及無(wú)色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。

　?、跼NA沉淀

　　將水相上層轉移到一干凈無(wú)RNA酶的離心管中。加等體積yi丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm

　　離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見(jiàn)的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。

　?、躌NA清洗

　　移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀?；靹蚝?，4℃下7000rpm離心5分鐘。

　?、軷NA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。

　?、奕芙釸NA沉淀

　　溶解RNA時(shí)，先加入無(wú)RNA酶的水40μl用槍反復吹打幾次，使其溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。